Universitetet i Heidelberg, tysk Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, er det eldste og et av de mest prestisjefulle universiteter i Tyskland. Det ble grunnlagt i 1386 av kurfyrste Ruprecht I av Pfalz og var det tredje universitet som ble etablert under det tysk-romerske rike. Ved opprettelsen besto universitetet av fire fakulteter: teologi, juridikum, medisin og filosofi. Først i 1890 ble den femte selvstendige fakultet naturvitenskap. I 1969 ble det gjennomført en omorganisering til 16 fakulteter og i 2002 ble det strammet inn til 12 fakulteter. Universitet hadde rundt 25 000 studenter i 2008.
Universitet fungerte som et senter for teologer og jusseksperter under det tysk-romerske rike. Antallet studenter sank under tredveårskrigen, og lærestedet kom siden ikke over sine skattemessige og intellektuelle kriser før på tidlig på 1800-tallet. Institusjonen ble således igjen et sentralt lærested for uavhengige tenkere og utviklet seg til «humanismens fremste bastioner», og et senter for demokratisk tenkning. Imidlertid mistet universitet mange av sine dissentere og uavhengige professorer og ble et underlagt NSDAP i nazitiden (1933–1945). Etter krigen gjennomgikk lærestedet en omfattende avnazifisering og var et av de fremste stedene under de venstreorienterte protestene i Tyskland på 1970-tallet.
Moderne vitenskapelig psykiatri, psykofarmakologi, psykiatrisk genetikk, miljøfysikk, og moderne sosiologi ble introdusert som vitenskapelige fag og lærestedet har vektlagt forskning, noe som har ført til 55 nobelpriser. Det har konsekvent vært rangert blant Europas aller fremste universiteter, og har gjennomsnittlig 1000 doktorgrader hvert år, og hvor mer enn en tredjedel av doktorgradsstudentene kommer fra utlandet. Internasjonale studenter fra rundt 130 land utgjør mer enn 20 prosent av hele studentmassen. Heidelberg består av to større campus: et i Heidelbergs gamleby og et annet i Neuenheimer Feld i utkanten av byen. Universitets kjente alumni (tidligere studenter) omfatter elleve innenlandske og utenlandske statsoverhoder.